اسید چرب سلولی (FA) که به عنوان نشانگرهای زیستی در بیماری های مختلف انسانی شناخته می شوند، معمولاً توسط طیف سنج جرمی کروماتوگرافی گازی (GCMS) مورد تجزیه و تحلیل قرار می گیرند، که وقت گیر است. بنابراین، یک روش تجزیه و تحلیل با بهره وری بالا در مطالعات و تحقیقات بالینی مورد نیاز است. در این پژوهش، متیل استرهای اسید چرب (FAMEs) با مشتق سازی، پس از استخراج اسید چرب (FA) از گلبول های قرمز خون (RBC) تشکیل می شوند. طیف سنجی جرمی کروماتوگرافی گازی (GC/MS/MS) با یونیزاسیون شیمیایی ناشی از آمونیاک (CI) برای تجزیه و تحلیل در گلبول های قرمز انسانی استفاده شد. 703 نمونه سلول گلبول قرمز (Red Blood Cell – RBC) برای پروفایل اسید چرب توسط GC/MS/MS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. این روش تحلیلی با استفاده از یونیزاسیون تأثیر الکترون (EI) با GC/MS تک کلاسیک مقایسه شد.
دستگاه های مبتنی بر روش تاندم (Tandem) عموما به دستگاه هایی گفته می شوند که دارای چندین آنالیزور جرمی (Mass Analyzer) می باشند. اگر اضافه کردن آنالیزور جرمی در دستگاه های کروماتوگرافی گازی بکار برده شوند به آن GC/MS/MS گفته می شود، به این صورت هستند که در این دستگاه ها یون های دارای m/z مورد نظر توسط آنالیزور جرمی اول انتخاب می شود و بعد از آن با برخورد با گاز بی اثر شکسته شده و یون های حاصل توسط آنالیزور جرمی دوم تشخیص داده می شود.
گلبول های قرمز خون (RBC)
گلبول های قرمز خون که نام دیگر آنها اریتروسیت (Erythrocyte) می باشد، در مهره داران و جانداران دارای خون یکی از سلول های خونی می باشد که مسئول حمل و انتقال اکسیژن به سراسر بدن را دارند و دارای مقادیر زیادی آهن و هموگلوبین هستند. این گلبول های قرمز سلول هستند اما اندامک داخلی ندارند و به شکل سکه می باشند. اگر هر تغییری در شمل این سلول های مهم خونی بوجود آید باعث ایجاد بیماری در بدن می شوند.
اسید چرب (FA)
کربوکسیلیک اسید تک زنجیره آلیفاتیک بلند و خطی می باشد که می تواند اشباع شده یا اشباع نشده باشد. بیشتر این مولکول ها دارای تعداد اتم کربن زوج بوده و شاخه فرعی ندارند. اسید های چرب توسط بدن موجودات زنده تولید نمی شوند و وجود ندارند و منبع آنها سه نوع از استرها در بدن موجودات زنده؛ تری‌گلیسیریدها، فسفولیپیدها و کلسترول می باشد. این مواد جزو یکی از مهم ترین مواد رژیم غذایی موجودات زنده می باشند و حتما باید در بدن آنها وجود داشته باشند چرا که از اجزای ساختاری مهم، در سلول های بدن جانداران می باشند.
روش آنالیز اسید چرب در گلبول قرمز با دستگاه GCMS
استخراج اسید چرب از گلبول های قرمز به این صورت انجام شد که، 0.5 میلی لیتر خون کامل و 10 میلی لیتر از محلول 0.9 درصد سالین مخلوط و در 2500 گرم به مدت پنج دقیقه سانتریفیوژ شد. پس از دور ریختن ماده رویی، این روش شستشو یک بار دیگر تکرار شد. پس از آن، سلول ها با افزودن 1 میلی لیتر آب مقطر همولیز شدند و حداقل به مدت 30 دقیقه در دمای یخچال نگهداری شدند. سپس عصاره اسید چرب با 5 میلی لیتر محلول استاندارد داخلی (IS) مخلوط شد و در 2500 گرم به مدت پنج دقیقه سانتریفیوژ شد. محلول استاندارد داخلی حاوی 0.2mg/ml اسید چرب C17:1 در هگزان/ایزوپروپانول (3: 2) و 3 میلی لیتر محلول Na2SO4 (6.7%) بود. سپس فاز هگزان به یک لوله شیشه ای تمیز منتقل شده و با نیتروژن تبخیر و خشک شد. برای حل کردن اسید چرب، 1 میلی لیتر BF3 در متانول (14٪) اضافه شد و به مدت 10 دقیقه در دمای 100 درجه سانتیگراد برای استری شدن، نمونه کشت داده شد. سپس 1 میلی لیتر آب و 3 میلی لیتر هگزان پس از خنک شدن تا دمای اتاق به نمونه ها اضافه شد و سانتریفیوژ شد (2500 گرم به مدت پنج دقیقه). فاز هگزان به یک ظرف شیشه ای کوچک تمیز منتقل شد و با نیتروژن تبخیر شد. نمونه نهایی متیل استر اسید چرب در 250 میلی لیتر هگزان بود و می توانست در دمای 25- درجه سانتیگراد نگهداری شود. نمونه ها قبل از تجزیه و تحلیل به نسبت 1:20 با هگزان رقیق شدند.
نتایج آنالیز مقادیر اسید چرب در گلبول قرمز با دستگاه GC-MS/MS
برای مقایسه دو روش یونیزاسیون EI و CI، برای تجزیه و تحلیل متیل استر اسید چرب، طیف متیل استر اسید دوکوزاهگزانوئیک (DHA ، C22: 6n3) نشان داده شده است. در شکل A، طیف دستگاه کروماتوگرافی GC/MS با استفاده از EI تعداد زیادی قطعه کم جرم را نشان می دهد. برخی از قطعات مانند m/z = 67 ،m/z = 79 و m/z = 99 از ویژگی های اسید های چرب چند زنجیره ای (LC‑PUFA) هستند، با این حال خاص یا مرکب نیستند. به طور معمول، هنگام استفاده از تکه تکه شدن EI، یون مولکولی متیل استر اسید چرب قابل تشخیص نیست. برعکس، هنگام استفاده از CI، پیک طیف غالب GC/MS یون مولکولی (+[M + H])، m / z = 343 است (شکلB).
نمودار های مقایسه دو روش یونیزاسیون A) روشB EI) روش CI
پیک غالب دیگر ترکیب آمونیاک (+[M + NH4])، m/z = 360 است، زیرا آمونیاک به عنوان گاز واکنش دهنده برای CI استفاده شد. هر دو قطعه خاص-مرکب در نظر گرفته می شوند، زیرا از دست دادن آمونیاک (+[M + NH4] و +[M + H]) در حالت MS/MS می تواند به عنوان یک انتقال کمی استفاده شود. از آنجا که فقط آنالیت هایی با میل ترکیبی پروتون مناسب یونیزه شدند، حالت یونیزاسیون CI سطح پس زمینه شیمیایی را در مقایسه با حالت یونیزاسیون EI کاهش می دهد. یک روش با استفاده از CI و GC/MS/MS در حالت MRM برای تجزیه و تحلیل اسید چرب با زمان تجزیه و تحلیل کمتر از نه دقیقه بهینه شد. برای دستیابی به شناسایی و کمی سازی مناسب، یون های پیش ماده، زمان احتباس و یون های قطعه ای کمی و کیفی تعیین شد.
برای ارزیابی خطی بودن روش GC/MS/MS، یک سری رقت از یک مخلوط استاندارد متیل استر اسید چرب از 5 نانوگرم در میلی لیتر تا 20 میلی گرم در میلی لیتر در هگزان استفاده شد. همه آنالیت ها ضریب تعیین (R2) بهتر از 0.995 داشتند. یک سری رقت از 45 متیل استر اسید چرب در ماتریس نیز اندازه گیری شد. همه آنالیت ها، R2 بهتر از 0.992 داشتند و هیچ تداخل ماتریسی مشاهده نشد. دقت، LOD و LLOQ نیز با استاندارد متیل استر اسید چرب در سه غلظت مختلف ارزیابی شد. این دقت برای همه آنالیت ها در حد 90-110٪ بود و LOD و LLOQ در محدوده ng/mL کم بود. RSD برای دقت با استفاده از 10 فاکتور در اندازه گیری 10 برابر گلبول قرمز جمع آوری شده انسان، محاسبه شد.
در نتیجه شواهد نشان می دهد که روش تحلیلی GC/MS/MS ،CI بسیار قوی است و زمان آنالیز کوتاهی دارد. این روش کاربرد گسترده ای برای آنالیز متیل استر دارد.
با توجه به قابلیت های بالا دستگاه های GCMS، اگر قصد خرید این دستگاه را دارید کارشناسان فنی و باتجربه ری نور آزما آماده ارائه خدمات مشاوره و فروش و خدمات پس از فروش می باشند.
