غلظت اسید نوکلئیک را می توان به راحتی با استفاده از اسپکتروفتومتر مرئی ماوراء بنفش (UV-VIS) تعیین کرد. دستگاه اسپکتروفتومتر Shimadzu UV-1280 یکی از کارآمدترین دستگاه در این زمینه می باشد که دارای یک حالت روش زیستی به عنوان یک تابع استاندارد برای تعیین غلظت DNA و پروتئین می باشد. چنین نمونه هایی معمولاً در حجم میکرو (کمتر از 5 میکرولیتر) در دسترس هستند و سیستمی که قادر به اندازه گیری حجم میکرو با قابلیت تکرار بالا باشد ترجیح داده می شود. یک سوپر میکروکووت معمولی به طول 10 میلی‌متری، به حداقل 50 میکرولیتر نمونه نیاز دارد. Hellma TrayCell یک سل اولترا میکرو فیبر نوری است که برای آنالیز میکرو حجم UV-VIS اسیدهای نوکلئیک و پروتئین ها طراحی شده است. حجم مورد نیاز نمونه از 0.7 میکرولیتر تا 10 میکرولیتر بسته به طول مسیر مورد استفاده متغیر است.
روش Bio Mode دستگاه اسپکتروفتومتر UV-1280 شیمادزو
دستگاه اسپکتروفتومتر UV-1280 شیمادزو، یک دستگاه اسپکتروفتومتر تک پرتویی می باشد که قابلیت آنالیز نمونه ها در بازه ی طول موجی 190 تا 1100 نانومتر را دارا می باشد.
شکل (1) دستگاه اسپکتروفتومتر UV-1280 شیمادزو
دستگاه اسپکتروفتومتری مدل UV-Vis از برند شیمادزو دارای یک حالت روش زیستی متشکل از شش روش اندازه گیری است که عبارتند از:
- DNA Quantitation
- Lowry Method
- BCA Method
- CCB Method(Bradford Method)
- Biuret Method
- UV Method
از بین این روش ها برای اندازه گیری DNA، مورد اول یعنی روش DNA Quantitation را انتخاب می شود.
شکل (2) صفحه انتخاب روش Bio در دستگاه اسپکتروفتومتر UV-1280 شیمادزو
شکل (3) شامل فاکتور هایی است که در روش اندازه گیری کمی DNA با دستگاه اسپکتروفتومتر UV-1280 Shimadzu را نمایش می دهد. DNA دارای پیک جذب حداکثر در 260 نانومتر و حداقل در 230 نانومتر است. حداکثر جذب پروتئین در طول موج 280 نانومتر است. خلوص اسید نوکلئیک در یک نمونه بیولوژیکی معمولاً با نسبت جذب 260 نانومتر و 280 نانومتر تعیین می شود. فاکتورهایی که در اندازه گیری با دستگاه UV-1280 شیمادزو به روش کمی DNA در نظر گرفته شده در این صفحه نمایش داده است. نمونه های DNA خالص دارای A260/A230 بیش از 2.0 خواهند بود. اگر نسبت به طور قابل توجهی کمتر از حد انتظار باشد، ممکن است نشان دهنده وجود آلاینده ها باشد، به عنوان مثال کربوهیدرات ها و فنل که در 230 نانومتر جذب می شوند.
شکل (3) صفحه نمایش کمیت DNA در دستگاه اسپکتروفتومتر UV-1280 شیمادزو
Hellma TrayCell
ابعاد TrayCell از شرکت هلما معادل یک کووت استاندارد طول مسیر 10 میلی متری است که به آن اجازه می دهد تا در نگهدارنده کووت اسپکتروفتومتر قرار گیرد. TrayCell از یک سل اندازه گیری فیبر نوری و یک درپوش با یک آینه یکپارچه تشکیل شده است. همانطور که در شکل (4) نشان داده شده است، نور از طریق منشورها و فیبر نوری به سمت نمونه هدایت می شود، در آینه منعکس می شود و سپس به بیرون از TrayCell به آشکارساز روی ابزار هدایت می شود. فاصله مشخص شده بین پنجره سل و آینه در درپوش تضمین می کند که طول مسیر نوری دقیق است و ثابت می ماند.
شکل (4) شمای مسیر نور در سل TrayCell شرکت Hellma
درپوش 1 میلی متری یا 0.2 میلی متری یک مسیر نوری مشخص به ترتیب 1 میلی متر و 0.2 میلی متر ایجاد می کند. این ضریب رقت مجازی 1:10 یا 1:50 را در مقایسه با اندازه گیری با یک کووت استاندارد 10 میلی متری ایجاد می کند. این ویژگی باعث صرفه جویی در زمان و جلوگیری از خطاهای رقیق سازی می شود.
در این مثال، TrayCell با طول مسیر 1 میلی متر با دستگاه اسپکتروفتومتر UV-1280 برند Shimadzu برای اندازه گیری یک نردبان DNA 100bp از برند Promega استفاده شد. حجم نمونه مورد نیاز 3 میکرولیتر تا 5 میکرولیتر است. در اینجا مقدار 3 میکرولیتر نمونه برای اندازه گیری استفاده شد. مرجع همانطور که در شکل (5) نشان داده شده است روی پنجره سل پیپت شد و با درپوش سل پوشانده شد. اصلاح خط پایه به منظور خوانش خط صفر از شاهد و سل انجام شد. همین روش برای نمونه انجام شد. نمونه با فشار دادن دکمه [START] در UV 1280 اندازه گیری شد.
شکل (5) Hellma TrayCell
نتایج آنالیز نوکلئیک اسید با دستگاه اسپکتروفتومتر UV-1280 شیمادزو
نسبت جذب، غلظت DNA و غلظت پروتئین همانطور که در شکل (6) نشان داده شده است.
شکل (6) نمایش نتایج کمیت DNA در دستگاه اسپکتروفتومتر UV-1280 شیمادزو
جدول [1] مقادیر جذب انحراف استاندارد نسبی (RSD) را برای ده اندازه گیری تکراری در 260 نانومتر نشان می دهد. SD کم 0.004 و RSD خوب 1.32 درصد به دست آمد.
جدول [1] جذب نردبان DNA ده بار در 260 نانومتر اندازه گیری شد
| Absorbance at 260 nm | |
| 0.272 | 1 |
| 0.277 | 2 |
| 0.282 | 3 |
| 0.274 | 4 |
| 0.273 | 5 |
| 0.273 | 6 |
| 0.269 | 7 |
| 0.278 | 8 |
| 0.275 | 9 |
| 0.279 | 10 |
| 0.275 | Average |
| 0.004 | SD |
| 1.32 | RSD (%) |
Hellma Traycell به همراه حالت روش Bio دستگاه اسپکتروفتومتر UV-1280 شیمادزو اندازه گیری آسان حجم میکرو اسیدهای نوکلئیک را با قابلیت تکرار خوب فراهم می کند.
شرکت ری نور آزما به ارائه انواع دستگاه ها و تجهیزات آزمایشگاهی مانند دستگاه های اسپکتروفتومتر UV-Visible را با طیف وسیعی از برند های برتر جهان مانند شیمادزو می پردازد. کارشناسان مجرب شرکت ری نور آزما آماده پاسخگویی به سوالات شما عزیزان در زمینه خرید و ارائه خدمات فنی می باشند.
