اصول کار دستگاه اسپکتروفتومتر

دنیای پیرامون ما مملو از امواج الکترومغناطیسی است که حرکت و انرژی را حمل می کنند. امواج الکترومغناطیسی طیف وسیعی از امواج شامل امواج رادیویی تا پرتوهای گاما را شامل می شوند. بخش قابل رویت این طیف شامل نور ماورابنفش و نور مرئی است که توسط روش طیف سنج جرمی مرئی با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر تک پرتویی و دو پرتویی (UV-Visible Spectroscopy) با عبور نور از نمونه و اندازه گیری مقدار نور جذب شده در یک طول موج معین قابل اندازه گیری هستند. از این روش در علوم متعددی چون شیمی، بیوشیمی به منظور شناسایی و تعیین کمیت ترکیبات استفاده می شود. نتایج حاصل از این اندازه گیری ها به کاربر اطلاعاتی در خصوص ساختار الکترونیکی نمونه، غلظت و پیوند های شیمیایی آن می دهد.

نور تکفام و نور سفید

نور ساطع شده از یک منبع نوری مخلوطی از چندین طول موج مختلف می باشد (البته برخی از آنها  مانند منبع نور لیزر پرتوهایی با طول موج خاص منتشر می کنند، یا برخی دیگر مانند لامپ های جیوه نور با طول موج های مختلف ساطع می کنند). نور با یک طول موج معین که به طور انتخابی توسط یک مونوکروماتور و یا تکفام ساز استخراج می شود، نور تکفام و یا منوکروم شده نامیده می شود. نوری که تمام پرتوهای موجود در محدوده طول موج پرتوهای مرئی را شامل می شود، نور سفید نامیده می شود. رابطه طول موج و رنگ به صورت زیر است:

هنگامی که نور سفید به ماده ای تابیده می شود و ماده نور آبی را جذب می کند، زرد به نظر می رسد که رنگ مکمل آبی (افزودنی) است. اگر نور تک رنگ آبی به این ماده تابیده شود، نور جذب شده و ماده، سیاه به نظر می رسد که نشان می دهد رنگی وجود ندارد.

انرژی(E) نور را می توان به صورت زیر بیان کرد:

E = Ch/λ

C سرعت نور، h ثابت پلانک و λ طول موج است. هنگامی که نور به ماده ای تابیده می شود، با توجه به ساختار مولکولی آن ماده نور با یک طول موج معین جذب آن ماده می شود. در نتیجه این واقعیت اتفاق می افتد که الکترون های موجود در حالت پایه مولکول، انرژی نور را جذب و  به حالت برانگیخته در می آیند. مقدار جذب نور، بسته به طول موج متفاوت است و بنابراین طیف جذب یا اصطلاحا اسپکترام هر ماده (منحنی اندازه گیری جذب هنگامی که نور تک رنگ به ماده ای با طول موج های متفاوت تابش می شود) منحصر به آن ماده می شود.

آنالیز مواد بر اساس این اصل، جذب سنجی نامیده می شود و این روش اجازه شناسایی، آنالیز کمی و آنالیز حالت الکترونی را می دهد. همچنین مولکول برانگیخته شده در اثر گرما و برخورد با مولکول های دیگر انرژی خود را از دست می دهد و به حالت اولیه خود باز می گردد. به این فرآیند «انتقال بدون تشعشع» می گویند.

علاوه بر حالت انتقال انرژی بدون تشعشع، مولکول ممکن است انرژی نور جذب شده را هنگام بازگشت به حالت پایه به صورت نور ساطع کند. در این حالت ماده، نور فلورسنت ساطع نموده و فسفرسانس رفتاری را از خود نشان می دهند و آنالیز با استفاده از این پدیده ها فلورومتری نامیده می شود.

قانون بوکر-بیر

قانون بوکر-بیر یکی از قوانین اصلی در مبحث طیف سنجی فوتومتری و اپتیک است. قانون بوکر-بیر رابطه بین شدت نور جذب شده توسط یک ماده و خصوصیات آن ماده را بیان میکند. به طور کلی، این قانون میگوید که جذب نور توسط یک محلول با غلظت مواد حل شده در آن و طول مسیری که نور از آن عبور میکند، تناسب دارد.

قانون بوکر-بیر که اصل اساسی تحلیل کمی است، قانون “لامبرت بیر” نیز نامیده می شود.

هنگامی که نور با شدت Io به ماده خاصی تابیده می شود و نور با شدت I عبور می کند، فرمول زیر برقرار است:
I = Io × 10.k.c.l

جایی که K مخفف ثابت متناسب است.

در این زمان، I/Io عبور (T)، I/Io × 100 درصد عبور (%T) و (1/T) = log (Io/I) جذب (Abs) نامیده می شود.

به عبارتی لگاریتم نور اولیه/ نور ثانویه جذب (Abs) نامیده شده و درصد نور ثانویه/ نور اولیه عبور یا T نامیده می شود.
T = I/Io = 10.k.c.l
Abs = log(1/T) = log(Io/I) = k.c.l
همانطور که از فرمول بالا مشخص است، عبور نور با غلظت نمونه متناسب نیست، بلکه جذب متناسب با غلظت نمونه (قانون بیر) و متناسب با طول مسیر نور است (قانون بوکر). همچنین ضریب ثابت تناسب (k) در زمانی که طول مسیر نور 1 سانتی متر و غلظت نمونه یک مول بر لیتر(mol/l) باشد را ضریب جذب مولی می گویند و با علامت ε نشان داده می شود. این ضریب جذب مولی به یک مقدار منحصر به فرد در شرایط خاص تبدیل می شود. برای تحقق قانون بوکر-بیر، رعایت شرایطی مانند عاری بودن از نور سرگردان، انتشار، پراکندگی و انعکاس ضروری است.

تحلیل کیفی و کمی نتایج دستگاه اسپکتروفتومتر

آنالیز کیفی به آنالیزی گفته می شود که در آن مشخص می شود که ماده چیست و از چه اجزایی تشکیل شده است، در حالی که به آنالیز اندازه گیری مقدار این مواد آنالیز کمی گفته می شود.

طیف و ساختار شیمیایی (تحلیل کیفی)

جذب نور ماوراء بنفش/مرئی وابسته به وجود پیوندهای دو گانه مانند C=C، C=O، N=N و N=O و چندگانه و همچنین حضور گروه های عاملی مانند -OH، -NH2 و -SH در آنالیت می باشد. موقعیت جذب و شدت آن با داشتن جفت الکترون غیرپیوندی تغییر می‌کند و به ساختار شیمیایی مربوط می‌شود.

در این حالت، جذب ممکن است بسته به وجود گروه های پیوندی متنوع و نوع حلال تغییر کند. تغییرات جذب به سمت طول موج های بلندتر «حرکت باتوکرومیک» و حرکت آن به طول موج های  کوتاه‌تر «حرکت هیپسوکرومیک» نامیده می‌شود. همچنین افزایش جذب را «اثر هیپرکرومیک» و به کاهش آن «اثر هیپوکرومیک» می‌گویند.

آنالیز رنگ سنجی (تحلیل کمی)

آنالیز برای مقایسه تیرگی رنگ یک ماده را آنالیز رنگ سنجی (آنالیز کمی) می نامند. برای مواد شفافی که در ناحیه نامرئی اشعه ماوراء بنفش/نزدیک مادون قرمز جذب دارند، جذب آن ماده اندازه گیری شده و سپس مقدار آن در آنالیز رنگ سنجی استفاده می شود.

منحنی کالیبراسیون

روش کمی برای اندازه گیری غلظت نمونه با غلظت نامشخص با استفاده از جذب نمونه ی استاندارد با غلظت مشخص به دو روش ذیل صورت می گیرد:

1. روش منحنی کالیبراسیون

2. روش افزودن استاندارد

در روش منحنی کالیبراسیون، نمونه‌های استاندارد طبق یک روش مشخصی عمل می‌کنند و سپس برای جذب اندازه‌گیری می‌شوند. در منحنی کالیبراسیون محور عمودی جذب بدست آمده و محور افقی غلظت نمونه استاندارد می باشد. مواقعی وجود دارد که منحنی کالیبراسیون یک خط مستقیم ایجاد نمی کند، مانند زمانی که محلول مورد اندازه گیری بصورت سوسپانسیون است.

اگرچه منحنی کالیبراسیون هنگام استفاده از محلول شاهد مطمئناً از مبدا عبور می کند، اما اگر از آن استفاده نشود، منحنی ممکن است از مبدا عبور نکند، سپس غلظت آنالیت در نمونه ناشناخته با استفاده از این منحنی کالیبراسیون به دست می آید.
در روش افزودنی استاندارد، نمونه استاندارد به صورت مرحله ای به چهار یا چند نمونه محلول نمونه اندازه گیری با همان غلظت اضافه می شود.

مشابه روش منحنی کالیبراسیون، منحنی رابطه بین مقدار افزوده شده و جذب تهیه می شود. غلظت آنالیت در نمونه مجهول از نقطه ای که منحنی مربوطه از محور عمودی عبور می کند به دست می آید. این روش فقط زمانی اعمال می شود که منحنی مربوطه تا محدوده غلظت پایین خطی باشد. به طور کلی، طول موج جذب فوق العاده بزرگ به عنوان طول موج اندازه گیری برای آنالیز کمی استفاده می شود.

انتخاب حلال

معمولا نمونه مورد آنالیز به صورت محلول اندازه گیری می شود. بر این اساس، نوع و غلظت حلال باید مناسب باشد. حلالی که نمونه را به خوبی حل کرده و عاری از اثر متقابل باشد، جذب کمی در محدوده طول موج اندازه گیری داشته باشد و فراریت کمی داشته باشد.

یک ظرف درب دار برای حلال فرار ضروری است. به عنوان یک حلال، آب برای اندازه گیری جذب در محدوده اشعه ماوراء بنفش و مرئی بسیار عالی است، زیرا خود جذبی ندارد.  لذا بسیاری از حلال‌های آلی که معمولاً مورد استفاده قرار می‌گیرند، چون مانند آب بی رنگ هستند  ممکن است این اشتباه را ایجاد نمایند که در محدوده فرابنفش جذب ندارند.

حلال ها و محدوده طول موج عملیاتی موجود آنها به شرح شکل روبرو است:

انحنای منحنی کالیبراسیون

منحنی کالیبراسیون به طور کلی خطی است. با این حال، ممکن است به دلایل مختلف منحنی شود. دلایل احتمالی عبارتند از:

خطای الکترونیکی دستگاه

از آنجایی که یک دستگاه اسپکتروفتومتر بلافاصله پس از برق رسانی به آن مقداری خطا دارد، باید اجازه داد تا 30 دقیقه یا 1 ساعت اصطلاحا گرم شود. خطا ممکن است در یک دوره زمانی طولانی مشاهده شود، بنابراین مهم است که دقت طول موج و دقت اندازه گیری را به صورت دوره ای با استفاده از فیلتر و غیره بررسی کنید.

نمونه فلورسنت

هنگامی که یک نمونه، نور فلورسنت ساطع می کند و زمانی که آن نور وارد آشکارساز می شود، ممکن است جذب کم به نظر برسد و با افزایش غلظت نمونه مقدار نور فلورسنت افزایش یابد. در نتیجه، منحنی کالیبراسیون ممکن است به سمت پایین خم شود. در صورت وقوع، لازم است با افزایش فاصله بین نمونه و آشکارساز یا با قرار دادن ماسک بین نمونه و آشکارساز، تا حد امکان تأثیر نور فلورسنت کاهش یابد.

نور سرگردان

نور سرگردان (Stray light) مجموع نور طول موج منحرف شده از عرض طیف معینی است که طول موج تنظیم شده تک رنگ در مرکز قرار گرفته و نور ناخواسته ساطع شده از تک رنگ است، اما از نمونه عبور نمی کند و از کنار نمونه عبور می کند. به عنوان مثال، با 0.1٪ نور سرگردان در نور تک رنگ، زمانی که نمونه ای با طول موج λ o و جذب 2 عبور نور با میزان 1٪ اندازه گیری می شود، با توجه به اینکه 0.1٪ نور سرگردان به 1٪ نور اصلی اضافه می شود.

نور با طول موج λ o، نور عبوری 1.1% عبور(معادل جذب 1.959) خواهد بود که باعث خطای 2% می شود. لذا واضح است، هر چه جذب نمونه بیشتر باشد، خطای ناشی از نور سرگردان با نسبت لگاریتمی بزرگتر می شود. برای کاهش نور سرگردان، به طور کلی می بایست از یک دستگاه با مونوکروماتور دوگانه متصل به هم استفاده نمود.اگرچه دستگاه دارای

مونوکروماتور دوگانه به دلیل داشتن مکانیسم پیچیده گران می باشد اما قابل ذکر است در این دستگاه مقدار نور سرگردان از یک پنجاهم (1/50) به یک هزارم (1/1000) در مقایسه با دستگاه اسپکترو فتومتر با مونوکروماتور تکی کاهش می یابد.

جدول زیر خطای جذب ناشی از نور سرگردان را نشان می دهد:

وسعت باند طول موجی:

یک لامپ WI (هالوژن) یا یک لامپ D2 (دوتریوم) به عنوان منبع نور اسپکتروفتومتر(Spectrophotometer) استفاده می شود. از آنجایی که این لامپ ها یک طیف پیوسته از خود ساطع می کنند، خارج کردن نور مونوکروم 500 نانومتری از کل طیف به این معنی نیست که فقط نور 500 نانومتر خارج می شود، بلکه نور در محدوده طول موجی که دارای عرض معین است خارج می شود.

از آنجا که ضریب جذب یک ماده بسته به طول موج متفاوت است، حتی اگر طول موج مرکزی یکسان باشد، با پهنای باند متفاوت، عرض طول موج نوری که باید خارج شود متفاوت است. این باعث می شود ضریب جذب از نظر ظاهری تغییر کند و به تبع آن جذب نیز تغییر می کند. کافی است پهنای باند یک اسپکتروفتومتر را از یک هشتم (1/8) تا یک دهم (1/10) نصف پهنای طیف جذب نمونه تنظیم کنید.

منظور از نصف عرض طیف جذب، عرض در نصف اوج طیف جذب است. از آنجایی که طیف جذب اغلب دارای نیمه پهنای وسیع در آنالیز کالریمتری است، پهنای باند 10 نانومتر کافی است. باریک کردن پهنای باند به دلیل کمبود انرژی نویز زیادی ایجاد می کند و ممکن است منجر به دقت اندازه گیری ضعیف شود. اگر پهنای باند بزرگ باشد، ارتفاع قله از نظر ظاهری کم می شود و این ممکن است باعث خم شدن منحنی کالیبراسیون شود.

انواع دستگاه اسپکتروفتومتر

اسپکتروفتومترها را می توان به طور کلی توسط سیستم های نوری به شرح زیر دسته بندی کرد:

پیکربندی دستگاه اسپکتروفتومتر

پیکربندی دستگاه اسپکتروفتومتر به دو دسته تک پرتو (Single beam) و دو پرتو (Double beam) تقسیم میشود.

پیکربندی تک پرتو

این پیکربندی تنها به یک پرتو اجازه می دهد تا از محفظه نمونه عبور کند. ابتدا با استفاده از سل پر از حلال، ضریب عبور را روی 100٪ یا جذب را روی 0 abs تنظیم کنید. سپس آن را با سل حاوی نمونه جایگزین کرده و اندازه گیری را انجام دهید.

پیکربندی دو پرتویی

این پیکربندی نور تک رنگ را با استفاده از آینه ها به دو پرتو تقسیم می کند، مانند یک آینه چرخان و یا یک آینه نیمه شفاف، تا دو پرتو، پرتو نمونه و پرتو مرجع ایجاد شود. هنگامی که سل حاوی نمونه برای پرتو نمونه و سل مرجع با حلال در آن برای پرتو مرجع در محفظه نمونه قرار می گیرد، هر نور عبوری وارد آشکارساز می شود. ویژگی این پیکربندی این است که عبور و جذب را می توان یک بار از نمونه با علامت I و مرجع با علامت Io به طور همزمان اندازه گیری کرد.

پیکربندی آشکارساز دستگاه اسپکتروفتومتر

پیکربندی آشکارساز دستگاه اسپکتروفتومتر نیز به دو دسته تک و دو پرتو تقسیم میشود.

پیکربندی دو پرتویی – تک آشکار ساز

در این پیکربندی، یک پرتو نمونه و یک پرتو مرجع به طور متناوب وارد یک آشکارساز می شوند. بنابراین برخلاف پیکربندی آشکارساز دوگانه، نتیجه کمتر تحت تأثیر تفاوت ویژگی‌های دو آشکارساز است.

پیکربندی دو پرتویی – دو آشکارساز

در این پیکربندی، پرتو نمونه و پرتو مرجع به ترتیب وارد آشکارسازهای مختلف می شوند. بنابراین، استفاده از دو آشکارساز با ویژگی های مشابه ضروری است. مزیت این پیکربندی این است که لازم نیست همیشه دو پرتو به یک آشکارساز مانند پیکربندی تک آشکارساز منتقل شود و بنابراین فضای بزرگتری در محفظه نمونه امکان پذیر است که برای اندازه گیری نمونه های نامشخص با نگه داشتن آنها راحت است.

تک مونوکروماتور و دو مونوکروماتور

سیستم های دارای دو مونوکروماتور دارای دو مونوکروماتور می باشد که به صورت سری (پشت سر هم) در دستگاه جایگذاری شده است. از این رو اگر در یک سیستم اسپکتروفتومتر دو مونوکروماتور (Double Monochromator Spectrophotometer) به صورت موازی جهت تولید دو طول موج مجزا قرار گرفته باشند، اساسا به معنای یک سیستم دابل مونوکروماتور نخواهد بود، حتی اگر دارای دو مونوکروماتور مجزا باشد. یک سیستم دابل مونوکروماتور نور ساطع شده از مونوکروماتور اولیه را دوباره در مونوکروماتور ثانویه تک فام می سازد و لذا با این ترفند نورهای سرگردان با  مقادیر بسیار ناچیز به دیکتور خواهند رسید  و بدین وسیله یک نور تکفام بسیار خالص تحویل دتکتور خواهد شد. در نتیجه یک منحنی کالیبراسیون کاملا خطی خوب به دست می آید، حتی اگر جذب بالا باشد، امکان آنالیز نمونه هایی با غلظت بالا فراهم می شود.

از سیستم دابل مونوکروماتور در دستگاه اسپکتروفتومتر مدل UV-2700 و دستگاه اسپکتروفتومتری مدل  UV-3600 Plus شیمادزو استفاده شده است.

سیستم اندازه گیری دستگاه اسپکتروفتومتر

سیستم اندازه گیری در دستگاه اسپکتروفتومتر دو دسته ی سیستم نوری و سیستم برق را شامل می شود.

1- سیستم نوری

دستگاه اسپکتروفتومتر UV-Vis مدل 1900i شیمادزو  یک مدل مناسب برای توضیح سیستم نوری در دستگاه اسپکتروفتومتر می باشد که در زیر نشان داده شده است.

نوری که از منبع نور، لامپ D2 (دوتریوم) یا لامپ WI (هالوژن) می آید، توسط آینه L.M منعکس می شود و سپس وارد مونوکروماتور می شود. جابجایی منبع نور کاملاً خودکار است و دستگاه، منبع نور بعدی را با چرخاندن آینه L.M با توجه به طول موج انتخاب می کند.

به استثنای منابع نور و آینه های منبع نور، سیستم نوری به گونه ای ساخته شده است که از قرار گرفتن در معرض گرد و غبار و آلاینده ها جلوگیری کند.

دیافراگم شکاف تک رنگ روی 1 نانومتر ثابت شده است.نوری که از مونوکروماتور خارج می شود از فیلتر برش نور سرگردان F عبور می کند و به آینه M3 برخورد می کند و سپس توسط تقسیم کننده پرتو B.S به پرتو سمت نمونه و پرتو سمت مرجع تقسیم می شود، که سپس از سلول های مربوطه عبور می کنند و به آشکارسازها برخورد میکند.

تصویر شکاف خروجی 52 در نزدیکی موقعیت سل در محفظه نمونه ظاهر می شود. ابعاد مقطع تیره به شرح زیر است:

• عرض تقریبی 0.8 میلی متر
• ارتفاع تقریبی 9 میلی متر

در صورت امکان، لطفاً هنگام استفاده از میکروسل‌ها از سل‌های سیاه رنگ استفاده کنید، زیرا نور پراکنده بر آن‌ها کمتر تأثیر می‌گذارد.

2- سیستم برق دستگاه اسپکتروفتومتر

مرکز کنترل میکروکامپیوتر (CPU) است که تمامی کنترل های منابع نور، سوئیچینگ منابع نور، تعویض فیلتر، موتور پالس اسکن طول موج، پنل لمسی، چاپگر، رابط USB، رابط LAN و غیره را انجام می دهد. پس از اینکه پرتوی سمت نمونه و پرتوی سمت مرجع توسط آشکارسازها (فتودیودها) گرفته شده و توسط پیش تقویت کننده به ولتاژ تبدیل می شوند. سپس سیگنال به یک مبدل AID وارد می شود و در نهایت توسط CPU خوانده می شود. در حالت اندازه گیری انرژی (حالت طیف) فقط سیگنال از پرتوی سمت نمونه خوانده می شود. در این مورد، وضعیت سوئیچینگ آستانه “عادی” است. اگر وضعیت “معکوس” باشد، فقط سیگنال از پرتو سمت مرجع خوانده می شود.

شرکت ری نور آزما به ارائه انواع دستگاه های اسپکتروفتومتر با طیف وسیعی از برند های برتر جهان می پردازد. کارشناسان مجرب شرکت ری نور آزما آماده پاسخگویی به سوالات شما عزیزان در زمینه خرید و ارائه خدمات فنی می باشند.