ارزیابی خواص پروتئین غشایی با استفاده از سیستم Hplc

سلول ها، کوچکترین واحدی که بدن انسان را تشکیل می دهد، توسط غشایی متشکل از لیپیدها پوشیده شده است. پروتئین های غشایی مختلف در غشای سلول قرار دارند و اطلاعات را از خارج سلول دریافت می کنند و مواد را به داخل و خارج سلول منتقل می کنند. این پروتئین‌های غشایی نه تنها به این دلیل که با پدیده‌های مهم بیولوژیکی مرتبط هستند، بلکه به‌عنوان مولکول‌های هدف داروها نیز مورد توجه قرار گرفته‌اند. برای درک عملکرد پروتئین های غشایی و نحوه اتصال و پاسخ آنها به داروها، اطلاعات ساختاری سه بعدی آنها بسیار مفید است. با این حال، یک گلوگاه اصلی در تعیین ساختار، تهیه مقدار کافی از نمونه‌های پروتئینی بسیار خالص است که برای تجزیه و تحلیل میکروسکوپی کریستالوگرافی اشعه ایکس و کرایو الکترونی مورد نیاز است. علاوه بر این، اگرچه خالص‌سازی پروتئین‌های غشایی نیاز به استخراج آن‌ها از دو لایه لیپیدی با استفاده از مواد شوینده دارد، پروتئین‌های غشایی عموماً ناپایدار هستند و به راحتی در طول حل شدن دناتوره می‌شوند. با توجه به این مشکلات فنی، تعداد ساختارهای پروتئین غشایی در واقع تا همین اواخر محدود بوده است.

 FSEC و کروماتوگرافی مایع در ارزیابی خواص پروتئین غشایی

برای غلبه بر این مشکلات، ارزیابی سطح بیان و پایداری نمونه‌های متعدد به شیوه‌ای ساده و راحت، و انتخاب پروتئین‌های غشایی “بسیار بیان شده” و “بسیار پایدار” مناسب برای آنالیز ساختاری بسیار مهم است. کروماتوگرافی حذف اندازه تشخیص فلورسانس (FSEC) برای غربالگری سریع و راحت آن پروتئین ها توسعه یافته است. در این روش، یک برچسب پروتئین فلورسنت سبز (GFP) به یک پروتئین غشایی هدف ذوب می‌شود. رفتار پروتئین سپس با تشخیص فلورسانس GFP در کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل، که امکان تجزیه و تحلیل پروتئین هدف را در وضعیت خالص نشده ارزیابی می‌کند. یک نمونه‌بردار خودکار و یک آشکارساز فلورسانس بسیار حساس نصب شده در یک سیستم Hplc، تجزیه و تحلیل مداوم نمونه‌های متعدد و تشخیص نمونه‌ها را به ترتیب در مقادیر کم امکان‌پذیر می‌سازد. FSEC یک تکنیک آزمایشی ضروری است و سیستم کروماتوگرافی مایع که برای FSEC سفارشی شده است، در حال حاضر پرکاربردترین ابزار آزمایشی است.

آماده سازی نمونه برای ارزیابی خواص پروتئین غشایی

تحقیقات اخیر در مورد تجزیه و تحلیل ساختاری پروتئین های غشایی در درجه اول بر روی پروتئین های غشایی از یوکاریوت های بالاتر مانند انسان و موش متمرکز شده است. همراه با این روند، سلول های HEK293 و سلول های Sf9 به عنوان سیستم های بیانی برای بیان گذرا پروتئین های غشای نوترکیب مورد استفاده قرار گرفته اند، زیرا این سلول ها برای بیان پروتئین های یوکاریوتی مناسب هستند. با در نظر گرفتن آن سلول های کشت شده به عنوان مثال، این بخش مراحل از برداشت سلول های بیان کننده پروتئین های غشایی تا تجزیه و تحلیل FSEC را شرح می دهد.

تفکیک نمونه (زمان مورد نیاز: حداکثر 10 دقیقه)

مقادیر کمی از سلول های بیان کننده پروتئین غشایی جمع آوری شده و پلت می شوند. برای سلول‌های Sf9 که در حالت شناور و آزاد رشد می‌کنند، معمولاً تقریباً ۱ میلی‌لیتر محلول کشت جمع‌آوری می‌شود. برای سلول‌های HEK293 که در شرایط چسبنده رشد می‌کنند، سلول‌های یک چاه روی صفحه 6 یا 12 چاهی جمع‌آوری می‌شوند. سوسپانسیون سلولی جمع آوری شده با سرعت کم سانتریفیوژ می شود تا مایع رویی کشت حذف شود و گلوله سلولی به دست آید.

حل شدن با مواد شوینده (زمان مورد نیاز: 30 تا 60 دقیقه)

حدود 200-300 میکرولیتر از محلول حاوی بافر، نمک و مواد شوینده به گلوله سلولی اضافه می شود تا گلوله در محلول معلق شود. سپس سوسپانسیون با وارونگی به مدت 30 تا 60 دقیقه در دمای پایین مخلوط می شود تا پروتئین های غشایی حل شوند. به سادگی تعلیق گلوله بدون اختلال در سلول فیزیکی توسط فراصوت برای حل شدن کافی است زیرا غشای سلولی HEK293 و Sf9 ضعیف هستند.
از آنجایی که دودسیل مالتوزید (n-Dodecyl-β-D-maltoside) اغلب به عنوان ماده شوینده حل کننده انتخاب می شود، احتمال وجود مواد شوینده دیگر نیز بررسی می شود و آن را به عنوان نقطه شروع در نظر می گیریم.

حذف مواد نامحلول (زمان مورد نیاز: 20 دقیقه)

محلول نمونه پس از انحلال اغلب حاوی بقایای سلولی و دانه های پروتئینی است که در حضور مواد شوینده تولید می شوند. از آنجایی که تزریق آن مواد همانطور که هست به سیستم Hplc ممکن است خطوط جریان و ستون های آن را مسدود کند، محلول نمونه حل شده به مدت تقریباً 20 دقیقه اولتراسانتریفیوژ می شود تا گلوله شود و مواد نامحلول از محلول حذف شود. پس از اولتراسانتریفیوژ، مایع رویی به یک ویال منتقل می شود و روی قفسه نمونه دستگاه نمونه برداری خودکار قرار می گیرد.

تجزیه و تحلیل (زمان مورد نیاز: 20 تا 60 sample/min)

نمونه گیری خودکار برای تزریق 30 تا 100 میکرولیتر از نمونه به ستون فیلتراسیون ژل استفاده می شود و نمونه با محلولی حاوی محلول بافر، نمک و مواد شوینده شستشو داده می شود. زمان تحلیلی و سرعت جریان فاز متحرک بسته به نوع ستون فیلتراسیون ژل مورد استفاده متفاوت است. اگر نمونه‌های زیادی در یک توالی آنالیز شوند، برخی از نمونه‌ها می‌توانند در حالی که منتظر تزریق هستند، دناتوره شوند، بنابراین تفسیر نتایج را با مشکل مواجه می‌کند. به همین دلیل، تعداد نمونه‌ها در یک آنالیز دسته‌ای پیوسته باید به نمونه‌ای محدود شود که حداکثر می‌توان یک شبه کامل کرد (حداکثر 12 ساعت). همانطور که در بالا توضیح داده شد، کل زمان مورد نیاز برای پیش تصفیه از جمع آوری نمونه تا شروع آنالیز حدود 2 ساعت است. این روش‌ها بسیار ساده و آسان هستند و از آنجایی که مراحل کمی در آن وجود دارد، می‌توان اثرات رویه‌ها را بر روی پروتئین‌ها اساساً حذف کرد و امکان ارزیابی خواص اولیه پروتئین مورد نظر را فراهم کرد. از آنجایی که محلول بافر، غلظت نمک و مواد شوینده مورد استفاده در انحلال باید برای هر نمونه بهینه شود، یک ترکیب بهینه بر اساس پروفایل های شستشو به دست آمده توسط FSEC ارزیابی می شود.

نتایج ارزیابی خواص پروتئین غشایی با Hplc و FSEC

یک مثال واقعی از داده های به دست آمده توسط GFP-FSEC در اینجا نشان داده شده است. در آزمایش نشان‌ داده‌ شده در سمت راست، ناقل‌های غشایی A از گونه‌های مختلف به‌طور گذرا در سلول‌های HEK293 بیان شدند و خواص آنها با روش GFP-FSEC، با هدف تعیین ساختاری ناقل غشای یوکاریوتی A، ارزیابی شد. گلوله سلولی از یک چاه روی یک صفحه 12 چاهی در 250 میکرولیتر از یک بافر انحلال‌ سازی تعلیق شد، پیش تیمار شد و با استفاده از ستون ENrichTM 650 از Bio-Rad، تحت حجم تزریق 30 میکرولیتر مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

همانطور که در شکل زیر نشان داده شده است، منحنی گونه 1 یک قله منفرد را نشان می دهد. در مقابل، مشخصات گونه 2 دو قله را نشان می دهد که نشان می دهد دو حالت مختلف در نمونه درگیر هستند. از منحنی گونه 3، این نکته استخراج می شود که  برخی از تجمعات ناهمگن در نمونه رخ داده است زیرا منحنی به طور گسترده، گسترش می یابد. از آنجایی که منحنی گونه 4 اوج آشکاری را نشان نمی دهد، می توان فرض کرد که سطح بیان کم یا انحلال ناکافی بوده است. از مشاهدات بالا، نمونه از گونه 1 را می توان برای تحقیقات تحلیل ساختاری بهینه در نظر گرفت، و آزمایش بعدی می تواند ادامه یابد. اگرچه مثال در اینجا یک مقایسه بین گونه‌های مختلف را نشان می‌دهد، یک روش مشابه می‌تواند برای مقایسه یک نمونه با جهش‌های مختلف معرفی‌شده یا همان نمونه حل شده در محلول‌هایی با اجزای مختلف اعمال شود.

اگر قصد خرید دستگاه های کروماتوگرافی را دارید، مشاوران فنی شرکت ری نور آزما آماده ارائه مشاوره رایگان خرید و همینطور خدمات پس از فروش به شما مشتریان گرامی می باشند.