کروماتوگرافی مایع یکی از متداول ترین روش های جداسازی، برای ترکیبات غیر فرار مثل ترکیبات یونی یا پلیمر ها، ترکیبات ناپایدار حرارتی مانند مواد منفجره و ترکیبات فعال و پر تحرک مانند مواد بیولوژیکی می باشد. در کروماتوگرافی مایع اگر بتوان نمونه را در یک حلال حل کرد، بسیاری از جداسازی ها در در جه حرارت کم انجام خواهند شد. برای این روش جداسازی ستون نقش بسیار مهمی را دارد. این که ستونی که برای جداسازی انتخاب می شود چه ویژگی هایی داشته باشد و برای چه موادی مناسب است امری بسیار مهم است که در ادامه به ویژگی های ستون های کروماتوگرافی مختلف اشاره می کنیم.
ستون کروماتوگرافی مایع چیست؟
ستون در کروماتوگرافی مایع یکی از اجزای مهم در عمل جداسازی می باشد. پس از اینکه نمونه به دستگاه تزریق شد، نمونه اول به قسمت پیش ستون (Pre-column) وارد می شود. این قسمت قبل از ستون قرار می گیرد و از ستون اصلی محافظت می کند. این ستون طول کمی دارند در حد چند سانتی متر و جنس ماده پر شونده آن مطابق با نمونه تزریقی متفاوت است چون از خرابی ستون اصلی جلوگیری شود. ستون ها انواع مختلفی دارند و براساس نمونه و روش و مدت زمان جداسازی و شرایط دیگر انتخاب می شوند. ستون های کروماتوگرافی طولی در محدوده 10 تا 30 سانتی متر دارند و داخل آنها با دو نوع ماده پر می شوند که متخلخل یا پوسته دار هستند و متناسب با نمونه ای که وارد آنها می شود انتخاب می شوند. نوع ماده ای که ستون محافظ و ستون اصلی را پر می کند باید مشابه یکدیگر باشند. جنس هر دو ستون از فولاد ضد زنگ می باشد. ستون ها بسته به روش جداسازی نمونه می توانند قطبی باشند یا غیر قطبی و بر این اساس انتخاب می شوند.
نحوه عملکرد ستون کروماتوگرافی مایع
کروماتوگرافی مایع دارای دو فاز ساکن یا متحرک می باشد. قسمت فاز ساکن همواره به صورت ستون است و از موادی پر شده است که اندازه هایی در حد میکرومتر دارند و می توان میزان کم تراکم یا پر تراکم براساس روش جداسازی آنها را انتخاب کرد. اساس کار ستون های کروماتوگرافی براساس زمان بازداری می باشد. هر ستون بر اساس زمان بازداری که دارد و همچنین بر اساس قطبیت ستون، جداسازی نمونه را انجام می دهد و به سمت دتکتور برای شناسایی فرستاده می شود. زمانی که کار جداسازی انجام شد باید ستون های کروماتوگرافی را برای انجام جداسازی بعدی و افزایش کیفیت آن شستشو داد. که ستون های قطبی را با محلول های غیرقطبی و ستون های غیرقطبی را با محلول های قطبی شستشو می دهند.
انواع ستون های کروماتوگرافی
براساس نوع جداسازی که انجام می شود باید ستون مخصوص با آن انتخاب شود. انواع ستون های کروماتوگرافی ستون های کروماتوگرافی فاز معکوس، کروماتوگرافی فاز نرمال، کروماتوگرافی میل ترکیبی، کروماتوگرافی اندازه طردی و کروماتوگرافی تبادل یونی می باشند.
ستون کروماتوگرافی فاز معکوس
در ستون کروماتوگرافی فاز معکوس، فاز متحرک به صورت آب گریز بوده و فاز ساکن به صورت قطبی می باشد. آبگریز بودن فاز ساکن نقش بسیار مهمی در ستون کروماتوگرافی فاز معکوس دارد که باعث می شود که مولکول های حل شونده به صورت مساوی هم در فاز ساکن و هم در فاز متحرک حضور داشته باشند. هر قدر فاز ساکن ناقطبی تر یا آب گریز تر باشد، زمان بازداری در ستون بیشتر خواهد بود و اگر قصد جداسازی ترکیبات معدنی یونیزه شده، یون‌های معدنی و مولکول‌های فلزی قطبی را دارید، به دلیل اینکه زمان بازداری آن ها کمتر می باشند، این ستون برای جداسازی این ترکیبات خیلی مناسب نمی باشد. علاوه بر آن جداسازی و شناسایی انواع ویتامین های محلول در آب، کربوهیدرات ها و شکر، آنتی بیوتیک و غیره از ویژگی های این ستون کروماتوگرافی مایع می باشد. یکی از مزایای مهم این ستون شناسایی تعداد ترکیبات زیاد می باشد.
ستون کروماتوگرافی فاز نرمال
در این ستون فاز متحرک ناقطبی می باشد اما فاز ساکن از ذراتی که ناقطبی هستند تشکیل می شود. آب در ستون کروماتوگرافی فاز نرمال در فاز متحرک به صورت یک حلال مهم می باشد که زمان بازداری را تغییر می دهد. علاوه بر آب، اگر از حلال های با ویسکوزیته پایین استفاده شود، سرعت جریان افزایش می یابد به این صورت زمان بازداری کاهش می یابد. این روش برای جداسازی ترکیباتی که در آب حل می شوند، ایزومرها و مولکول های آب دوست یا آبگریز،نمونه های قطبی و خالص سازی ترکیبات خام و غیره استفاده می شود.
ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی
با استفاده از کروماتوگرافی میل ترکیبی می توان یک مولکول زیستی در یک ترکیب خاص را بر اساس اتصال ماکرومولکولی در برهم کنش بین مولکول زیستی و ماده ای دیگر جداسازی کرد. بیشتر از این روش در جداسازی های علم زیست شناسی استفاده می شود. کروماتوگرافی میل ترکیبی به این صورت است که بین نمونه و فاز ساکن واکنش هایی اتفاق می افتد که این روش جداسازی ار آن استفاده می کند.
کروماتوگرافی تبادل یونی
در ستون کروماتوگرافی یونی، فاز ساکن و متحرک دارای بار های مخالف یکدیگر می باشند و جداسازی هم براساس جذب یون های ناهمنام و مقدار بار های آنها می باشد. فاز ساکن را لایه نازکی از سیلیکا و رزین می پوشاند و به همین ترتیب کاتیون و آنیون روی این مواد قرار می گیرند و با آنها پیوند شیمیایی تشکیل می دهند. این ستون توانایی آنالیز های مقداری در غلظت‌های پایین حل‌شونده را دارد. از این ستون برای جداسازی آنیون های معدنی محلول در آب، در صنایع غذایی برای جداسازی و تعیین مقدار نیتروژن، گوگرد، فسفر و یون‌های هالی موجود و همچنین ترکیبات محلول در آب اسید سولفونیک ها و غیره استفاده می کنند. یک از مواردی مهمی که با استفاده از این ستون جداسازی آن انجام می شود، تخلیص پروتئین ها می باشد.
کروماتوگرافی اندازه طردی
از ستون کروماتوگرافی اندازه طردی در جداسازی بر اساس اندازه مولکول ها استفاده می شود. به این گونه که نمونه از داخل ستون عبور می کند و چون مکانیسم این ستون جدا کردن مولکول های بزرگ و درشت از مولکول های ریز می باشد، مولکول های ریز بین منافذ فاز ساکن گیر افتاده و در ستون باقی می مانند و مولکول های درشت نیز با زمان ماند بالا از ستون خارج می شوند.
بنابراین آزمایشگر براساس نیاز هایی که دارد و جداسازی که می خواهد انجام دهد، ستون مورد نظر خود را براساس مکانیسم های مرتبط به آن انتخاب می کند.
