تعیین دمای تخریب مولکول DNA با اسپکتروفتومتر

بررسی تخریب مولکول DNA با افزایش دما با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر UV-Visible

یکی از کاربرد های جالب دستگاه اسپکتروفتومتر مرئی − فرابنفش تعیین میزان تخریب مولکول DNA در موجودات مختلف می باشد. DNA یک مایکرومولکول زنجیره ای است که نقش مهمی در نگهداری و انتقال ژن ها ایفا می کند و در سنتز پروتئین در سلول های موجوات زنده شرکت می کند. هنگاهی که به DNA موجودات آسیب وارد می شود، مولکول DNA توانایی های خود را از دست می دهد. بنابراین، اطلاع از سلامت مولکول DNA، نقش مهمی در تعیین خواص و اثر بخشی آن دارد. استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر UV-Visible یکی از جدیدترین روش ها در تعیین میزان سلامت مولکول DNA در آزمایشگاه می باشد.

بررسی تخریب مولکول DNA با افزایش دما

مولکول DNA از دو زنجیره پلی نوکلئوتید درست شده است که به صورت مارپیچ آرایش گرفته اند. هر نوکلئوتیدی در مولکول DNA از سه بخش اصلی گروه فسفات، قند پنج کربنی و یک جزء آلی نیتروژن دار تشکیل شده است. هنگامی که مولکول DNA در معرض حرارت و pH شدید و یا موادی مانند اوره و آمین قرار می گیرد، ساختار مارپیچ دوگانه آن دچار تغییراتی می شود و به یک ساختار تک رشته تبدیل می گردد. هنگامی که تغییر ساختار مولکول DNA اتفاق می افتد، برهمکنش ها بین دو پایه پیوندی قطع می شود و تغییرات مهمی در خواص فیزیکی آن رخ می دهد. از تغییراتی که در مولکول DNA تخریب شده اتفاق می افتد، افزایش تراکم شناور، کاهش ویسکوزیته و افزایش جذب UV در 260 نانومتر می باشد. پدیده افزایش جذب UV در مولکول DNA تخریب شده به عنوان اثر هایپرکرومیک شناخته می شود و یکی از بهترین راه های تشخیص مولکول DNA تخریب شده می باشد. بررسی میزان جذب در مولکول DNA به طور معمول توسط دستگاه اسپکتروفتومتر مرئی− ماوراء بنفش انجام می گیرد.

یکی از رایج ترین روش های مطالعه تخریب DNA، افزایش دما محلول DNA می باشد که باعث تخریب تدریجی مولکول DNA و جدا شدن رشته های آن و تغییر تدریجی در میزان جذب آن در 260 نانومتر می شود. معمولاً برای چنین تحقیقاتی از یک دستگاه اسپکتروفتومتر UV-Vis که قابلیت کنترل دمایی داشته باشد استفاده می گردد. با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر فرابنفش- مرئی با امکان کنترل دما می توان تخریب تدریجی مولکول DNA را با بررسی تغییرات در نور 260 نانومتر مشاهده کرد.

نمونه ای از طیف جذبی مولکول DNA در 260 نانومتر

اندازه گیری دمای تخریب مولکول DNA با اسپکتروفتومتر

در تحقیقی جهت بدست آوردن دمای تخریب مولکول DNA، سه نوع مولکول DNA انتخاب شد. مولکول های DNA انتخابی برای تحقیق حاضر شامل DNA باسیل اشریشیا کلی E-coli، غده تیموس گوساله و باکتری کلستریدیوم پرفرنژنس بودند. برای تعیین دمای تخریب مولکول های DNA انتخابی از دستگاه اسپکتروفتومتر UV با قابلیت کنترل دما استفاده شد. برای انجام آزمایش فوق اندازه گیری میزان جذب در 260 نانومتر از دمای 60 درجه سانتیگراد آغاز گردید و به تدریج با افزایش دما میزان جذب آن با اسپکتروفتومتر اندازه گیری و یادداشت شد. سپس نمودار جذب بر حسب دما برای هر سه مولکول DNA به طور دقیق رسم شد. بر اساس این نمودار میزان جذب در 260 نانومتر با دستگاه Spectrophotometer در ابتدا ثابت است، از یک دمایی به بعد که مولکول DNA شروع به تخریب می کند میزان جذب افزایش دارد و در نهایت پس از تخریب و جداسازی کامل مولکول، میزان جذب در یک مقدار ثابت باقی می ماند. با محاسبه دمای متوسط در منطقه افزایش جذب، مقدار دمای تخریب DNA آن مولکول بدست می آید. مقدار دمای تخریب DNA مولکول های مختلف در برخی از منابع علمی آورده شده است که می توان آن را با مقدار بدست آمده در تحقیق حاضر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر مرئی- فرابنفش مقایسه کرد.

تخریب مولکول DNA یک امر تدریجی است، ابتدا بخشی از دو رشته از هم جدا شده و فرآیند تا زمانی که هر دو رشته بطور کامل از هم فاصله بگیرند ادامه می یابد. در صورتی که دو رشته بطور کامل از هم جدا نشوند امکان احیای مولکول DNA وجود دارد. البته باید این نکته را هم متذکر شد که مولکول احیا شده به احتمال زیادی کاملاً شبیه به مولکول اولیه نیست. احیا حرارتی یکی از روش های احیای مولکول DNA می باشد که روند احیا آن را نیز می توان با دستگاه اسپکتروفتومتر UV و با اندازه گیری میزان جذب در 260 نانومتر و با کاهش تدریجی دما بررسی کرد.

در مورد DNA مولکول اشریشیا کلی، پس از سنجش دمای تخریب، احیای آن مجددا بررسی شد. دمای تخریب مولکول DNA برای E-coli مقدار 91.4C تعیین شده بود. برای احیای مولکول DNA فوق دما را به تدریج کاهش دادیم و مقدار جذب را در 260 نانونتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر بدست آوردیم. با توجه به اینکه مقدار جذب با فرآیند سرد کردن تغییر قابل توجهی نداشت، نتیجه میگیریم که مولکول DNA فوق به طور کامل تخریب شده است. در آزمایش دیگری دما را تنها تا 77 درجه افزایش دادیم سپس آن را به تدریج خنک کردیم و میزان جذب مولکول DNA با اسپکترومتر مرئی فرابنفش اندازه گیری شد. با توجه به اینکه مقدار جذب همزمان با کاهش دما، کاهش نشان داد نتیجه گرفتیم که مولکول DNA به طور کامل تخریب نشده بوده و طی فرآیند سرد کردن احیا شده است. هرچند مقدار جذب با مقدار اولیه آن تفاوت دارد، که نشان از تغییر در ساختار مولکول DNA احیا شده می باشد.