مبانی دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)

دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)، فرآیندی برای جداسازی، شناسایی و تعیین کمیت اجزا در یک مخلوط مایع است. اصل اساسی دستگاه HPLC جداسازی اجزا به دلیل برهمکنش متفاوت آنها با فاز ساکن در داخل ستون است. فاز متحرک نمونه را از طریق ستون حمل می کند و هر جزء در زمان متفاوتی که به عنوان زمان نگهداری آن شناخته می شود شستشو می شود. خروجی یک کروماتوگرام (Chromatogram) است. اجزای نمونه در حین عبور از ستون با فرآیند مهاجرت افتراقی از یکدیگر جدا میشوند.

برای هر پیک، زمانی که در آن پدیدار می شود، اجزاء نمونه را با توجه به یک استاندارد مشخص می کند. مساحت قله نشان دهنده کمیت اجزاء نمونه است.

 

اجزای اصلی سیستم دستگاه HPLC

سیستم دستگاه HPLC از اجزایی تشکیل شده است، این اجزا شامل گاز زدا (Solvent Degasser)، پمپ دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC Pump)، نمونه بردار خودکار (Autosampler)، آشکار ساز (Detector) و کوره ستونی (Column Oven) می باشد. در ادامه با این اجزاء بیشتر آشنا شوید:

آشکارساز: به آنالیت های جدا شده از ستون دستگاه HPLC پاسخ می دهد و یک سیگنال خروجی برای نرم افزار تولید می کند.

گاز زدا: گازهای هوا را از حلال ها در حین جریان به پمپ دستگاه HPLC حذف می کند.

پمپ دستگاه HPLC: حلال یا حلال ها را با فشار بسیار زیاد به سمت کروماتوگرافی پمپاژ میکند.

نمونه‌بردار خودکار: نمونه‌هایی را از ویال‌ها می‌گیرد و آنها را به جریان حلال ارائه شده توسط پمپ تزریق می‌کند.

کوره حاوی ستون: ستون دستگاه HPLC را در خود جای داده و دمایی را برای جداسازی های تکرارپذیر حفظ می کند.

آشکارسازهای موجود برای دستگاه HPLC

برای دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) آشکاسازهای مختلفی وجود دارد که برای تجزیه و تحلیل نمونه ها از آنها استفاده میشود. این آشکارسازها شامل موارد زیر می باشند:

آشکارسازهای UV/Vis

این آشکارسازها جزو آشکارسازهای جذبی هستند و برای شناسایی ترکیباتی که قادر به جذب نور در محدوده های طول موج فرابنفش (UV) و مرئی (Vis) هستند، استفاده میشوند. آشکارسازهای UV/Vis دارای قابلیت های زیر هستند:

• به آنالیت های کروموفوریک در محدوده 190 تا 800 نانومتر پاسخ می دهد.
• دارای قابلیت مانیتورینگ تک طول موج است.
• برای اکثر آنالیت های آلی خوب است.
• با شستشوی گرادیان سازگار است.

آشکارسازهای فتودیود آرایه (PDA)

از ویژگی های این آشکار سازها می توان به موارد ذیل اشاره نمود:

• به آنالیت های کروموفوریک در محدوده 190 تا 800 نانومتر پاسخ می دهد.
• دارای مانیتورینگ چند طول موجی است.
• دارای پروفایل طیفی کامل پیک های کروماتوگرافی است.
• برای اکثر آنالیت های آلی خوب است.
• با شستشوی گرادیان سازگار است.

آشکارسازهای فلورسانس

این آشکارساز فقط به آنالیت هایی پاسخ می دهد که به طور طبیعی از خود تابش فلورسانس پخش می کند یا می توان آنها را از طریق مشتق سازی فلورسانس کرد. فوق العاده حساس هستند و با شستشوی گرادیان سازگار می باشند.

آشکارسازهای ضریب شکست

آشکارسازهای ضریب شکست یک آشکارساز جهانی برای همه آنالیت ها در نظر گرفته شده است، خیلی حساس نیستند و با شستشوی گرادیان نیز سازگار نمی باشند.

آشکارسازهای پراکندگی نور تبخیری

آشکارسازهای پراکندگی نور تبخیری نیز یک آشکارساز تقریباً جهانی در نظر گرفته شده اند که به آنالیت های کروموفوریک و غیر کروموفوریک پاسخ می دهند. این آشکارساز دارای حساسیت نسبتاٌ خوبی است و با شستشوی گرادیان سازگار هستند.

آشکارسازهای طیف سنجی جرمی

آشکارسازهای طیف سنجی جرمی اطلاعات انبوه را برای شناسه آنالیت و توضیح ساختار ارائه می دهند، به همین دلیل متمایز از دیگر آشکارسازها می باشند. این آشکارسازها بسیار حساس هستند و با شستشوی گرادیان سازگاری دارند.

ستون های دستگاه HPLC

ستون های دستگاه HPLC معمولا با ذرات سیلیس (سلیسیم دی اکسید SiO₂) نفوذپذیر، بسته بندی شده اند.

انتخاب های شیمی ستون دستگاه HPLC بر اساس حلالیت نمونه

برای انتخاب ستون شیمیایی مناسب بر اساس حلالیت نمونه، چندین ملاک مهم وجود دارد:

1. نوع حلال: حلال باید با نمونه و فاز ساکن ستون سازگار باشد.
2. حلالیت نمونه: نمونه باید به خوبی در حلال انتخابی حل شود تا جداسازی بهینه صورت گیرد.
3. فاز ساکن ستون: نوع فاز ساکن (مثلاً سیلیکا، پلیمرها) باید با نوع نمونه و حلال سازگار باشد.
4. دمای ستون: دمای ستون باید با نقطه جوش حلال و پایداری نمونه سازگار باشد.
5. فشار سیستم: فشار سیستم باید به گونه ای تنظیم شود که حلال به خوبی از ستون عبور کند و جداسازی بهینه صورت گیرد.

پدیده بازداری آبگریز

ستون‌های فاز معکوس در دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) دارای فاز پیوندی روی سطح ذرات سیلیس هستند که ماهیت آبگریز دارد. به عنوان مثال می توان به ستون های کروماتوگرافی مایع C4،(2)C8، C18 و C30 اشاره کرد.

در اصل، اگر ماده ای قطبی باشد، مواد قطبی و یونی در آن حل می شوند. چنین ستونی تمایل به حفظ اجزای نمونه را دارد که آبگریز نیز هستند، تا زمانی که فاز متحرک در جذب آن برای آن جزء نمونه قوی‌تر نباشد. اجزای نمونه قطبی بیشتر تمایل دارند که سریعتر از ستون خارج شوند زیرا به میزان کمتری حفظ می شوند.

برای یک ستون فاز معکوس، از ترکیبی از حلال‌ها استفاده کنید که قطبیت کلی و (کمتر آبگریز) نسبت به فاز ساکن می‌دهند. به این ترتیب، اجزای نمونه دلیلی برای جذب به فاز ساکن (فاز باند ستونی) و مقاومت در برابر تمایل به جریان با فاز متحرک (حلال) دارند.

نمونه ای از بازداری هیدروفوبیک

بازداری هیدروفوبیک (Hydrophobic Retention) پدیده ای است که در آن مولکول های غیرقطبی تمایل دارند که از آب دوری کنند و به یکدیگر بچسبند. این پدیده به دلیل عدم توانایی مولکول های غیرقطبی در تشکیل پیوند هیدروژنی با مولکول های آب رخ میدهد.

مولکول های زیر به راحتی روی ستون C8 با فاز معکوس با استفاده از 50/50 استونیتریل/آب جدا می شوند. آلانین قطبی ابتدا از ستون شسته می شود.

و سپس ترفنیل غیر قطبی (Non-polar terphenyl) شسته می شود.

 

حالت های پمپاژ شستشوی ایزوکراتیک و گرادیان

بطور کلی در دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) حالت های شستشوی به دو دسته  شستشوی ایزوکراتیک (Isocratic Elution) و گرادیان (Gradient Elution) دسته بندی می شوند. در ادامه به بررسی این حالت می پردازیم.

شستشوی ایزوکراتیک در دستگاه کروماتوگرافی مایع

یک ترکیب واحد از حلال ها برای مدت زمان جداسازی استفاده می شود. پیک های شستشوی بعدی به دلیل پراکندگی وسیع تر از پیک های شستشوی اولیه هستند. باید اقداماتی برای شستشوی دوره‌ای ستون با قدرت حلال بالاتر انجام شود تا آن را از مواد غیرقابل تحملی که در اثر تزریق نمونه ایجاد می‌شود پاکسازی کند.

شستشوی گرادیان در دستگاه کروماتوگرافی مایع

در این نوع شستشو ترکیب حلال ها به صورت پیوسته یا گام به گام تغییر می کند. به طور کلی، قله ها در سراسر کروماتوگرام در مقایسه با شستشوی ایزوکراتیک تیزتر هستند. همچنین برخی از جداسازی ها ممکن است به دست آید که با استفاده از شستشوی ایزوکراتیک امکان پذیر نیست. زمان اجرای کروماتوگرام ممکن است در مقایسه با شستشوی ایزوکراتیک کوتاه تر باشد.

گرادیان غربالگری – قدرتمند برای توسعه روش

تفسیر: برای ستون LC با فاز معکوس که در آن A آب است و B آلی است، اولین تزریق، اجزای نمونه را نشان می دهد که همه قطبی هستند. بنابراین، جداسازی ضعیف است زیرا مواد در فاز ثابت تقسیم کمی را تجربه می کند. به عبارت دیگر، شرایط حلال ضعیف در شروع، ترکیبات نمونه را خیلی زود از بین می‌برد.

برای اینکه مواد بیشتر به فاز ساکن تقسیم شوند، شیب گرادیان را کاهش می دهیم تا استحکام فاز متحرک به سرعت افزایش پیدا نکند. مواد برای مدت طولانی تری باقی می مانند و شروع به جدا شدن از یکدیگر می کنند. توجه داشته باشید که ما همچنان ستون را با حلال قوی در پایان تزریق می‌شوییم تا به طور موثر ستون را تمیز کنیم.

ما شیب گرادیان را دوباره کاهش می دهیم تا زمانی که شروع به دیدن یک جداسازی خوب در بازه زمانی کنیم.

شرکت ری نور آزما به ارائه انواع دستگاه های HPLC با طیف وسیعی از برند های برتر جهان می پردازد. کارشناسان مجرب شرکت ری نور آزما آماده پاسخگویی به سوالات شما عزیزان در زمینه خرید و ارائه خدمات فنی می باشند.